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文章分享|通過等溫重組酶聚合酶擴增快速檢測草蝦中的肝腸胞蟲草蝦是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中的一種重要經濟物種,但近年來,寄生于其肝胰腺的肝腸胞蟲嚴重影響了其養(yǎng)殖產業(yè)。由于目前沒有有效的藥物或疫苗可以治療該病,快速而精準的檢測對于防止病害傳播至關重要。 EHP孢子掃描電鏡觀察結果A.放大9.0×103倍; B.放大5.0×104倍. 喬毅, 沈輝, 萬夕和, 范賢平, 蔣葛, 黎慧, 王李寶, 史文軍, 成婕. 南美白對蝦肝腸胞蟲的分離及形態(tài)學觀察. 中國水產科學, 2018, 25(5): 1051-1058. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17430. 肝腸胞蟲的檢測主要依賴于分子生物學方法,其中最常見的是PCR技術。然而,PCR技術雖然靈敏度高,但需要昂貴的PCR儀器和專業(yè)的實驗室環(huán)境,且操作復雜,不適合現場使用。為了解決這一問題,研究團隊開發(fā)了兩種基于MIRA技術的快速檢測方法,這些方法具有高靈敏度、快速反應和易操作的特點,能夠在現場不需要復雜實驗設備的情況下,對蝦體中的肝腸胞蟲進行高效、快速的檢測,填補了現有檢測方法不足的空缺。 文章所用的擴增試劑:DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎型)與DNA 恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型) MIRA技術是一種多酶恒溫快速核酸擴增技術。其核心原理是通過多種功能蛋白在常溫下協同作用,實現核酸的快速擴增,是能夠真正實現便攜式的現場快速核酸檢測的技術。 研究方法 樣本提取 研究團隊從遼寧省的三個蝦養(yǎng)殖場收集了感染和健康的草蝦樣本,并提取了草蝦的肝胰腺DNA。 引物設計 針對肝腸胞蟲的S8絲氨酸蛋白基因(基因庫登錄號:ON 182063),設計了三對MIRA引物。該基因具有獨特的活性位點,能夠保證檢測的特異性。 MIRA-AGE與MIRA-LFD檢測 (A) 優(yōu)化RPA-AGE反應溫度。M:DL 500標記物;N:陰性對照;分別為品系1-5:25°C、30°C、37°C、39°C和42°C。 (B) 優(yōu)化RPA-AGE反應時間。M:DL 500標記物;N:陰性對照;1:10 min;2:20 min;3: 30 min;4: 40 min。 (C) 優(yōu)化RPA-LFD反應溫度。N:陰性對照;1:25°C;2:30°C;3:37°C;4:39°C;5:42°C。 (D) 優(yōu)化RPA-LFD反應時間。N:陰性對照;1:5 min;2:10 min;3:20 min。 兩種MIRA檢測方法分別通過瓊脂糖凝膠電泳(MIRA-AGE)和膠體金側流免疫層析法(MIRA-LFD)實現檢測。研究團隊通過實驗優(yōu)化了反應溫度和時間。MIRA-AGE在37°C下進行30分鐘擴增,而MIRA-LFD則在37°C下僅需10分鐘即可完成擴增,5分鐘內即可讀取結果。 實驗結果 特異性與靈敏度 (A) RPA-AGE檢測的特異性。M:DL 1000標記物;P:蒿型腸孢菌;1:肝減少腸細胞;2:肝孢菌;3:微孢子蟲;4:白斑綜合征病毒;6:異常威克漢姆酵母;N:陰性對照。 (B) RPA-LFD檢測的特異性。P:蒿型腸孢菌;N:陰性對照;1:肝減少腸細胞;2:肝孢菌;3:微孢子蟲;4:白斑綜合征病毒;6:異常威克漢姆酵母。 (C) RPA-AGE對重組質粒梯度稀釋的敏感性。M: DL 500標記;N:陰性對照;1: 4.7×10^5拷貝/µL;2: 4.7×10^4拷貝/µL;3: 4.7×10^3拷貝/µL;4: 4.7×10^2拷貝/µL;5: 4.7×10拷貝/µL;6: 4.7拷貝/µL。 (D) RPA-LFD對重組質粒梯度稀釋的敏感性。N:陰性對照;1: 4.7×10^5拷貝/µL;2: 4.7×10^4拷貝/µL;3: 4.7×10^3拷貝/µL;4: 4.7×10^2拷貝/µL;5: 4.7×10拷貝/µL;和6: 4.7拷貝/µL。 實驗顯示,MIRA技術具有高度特異性,能夠準確檢測出肝腸胞蟲,而對其他病原體無反應。靈敏度方面,兩種方法的檢測下限均為4.7copies/µL,顯著高于傳統PCR檢測的靈敏度。 臨床樣本檢測 對30個臨床樣本的檢測結果顯示,MIRA-AGE與MIRA-LFD的陽性率均為70%,略低于qPCR80%的陽性率,但遠高于傳統PCR的56.7%的陽性率。 應用前景 基于MIRA的檢測方法能夠在恒溫下快速擴增目標基因,特別是MIRA-LFD方法在短短10分鐘內即可得到結果,無需復雜的實驗設備,非常適合在養(yǎng)殖場等現場環(huán)境中使用。該技術的高靈敏度和高特異性使其成為一種高效的現場檢測工具,有助于養(yǎng)殖者在早期發(fā)現和控制肝腸胞蟲的傳播,從而保護草蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。 |