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文章分享|通過等溫重組酶聚合酶擴增快速檢測草蝦中的肝腸胞蟲

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草蝦我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中的一種重要經濟物種,但近年來,寄生于其肝胰腺的肝腸胞蟲嚴重影響了其養(yǎng)殖產業(yè)。由于目前沒有有效的藥物或疫苗可以治療該病,快速而精準的檢測對于防止病害傳播至關重要。

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EHP孢子掃描電鏡觀察結果A.放9.0×103; B.放大5.0×104.

喬毅, 沈輝, 萬夕和, 范賢平, 蔣葛, 黎, 王李寶, 史文軍, 成婕. 南美白對蝦肝腸胞蟲的分離及形態(tài)學觀察. 中國水產科學, 2018, 25(5): 1051-1058. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17430.

肝腸胞蟲的檢測主要依賴于分子生物學方法,其中最常見的是PCR技術。然而,PCR技術雖然靈敏度高,但需要昂貴的PCR儀器和專業(yè)的實驗室環(huán)境,且操作復雜,不適合現場使用。為了解決這一問題,研究團隊開發(fā)了兩種基于MIRA技術的快速檢測方法,這些方法具有高靈敏度、快速反應和易操作的特點,能夠在現場不需要復雜實驗設備的情況下,對蝦體中的肝腸胞蟲進行高效、快速的檢測,填補了現有檢測方法不足的空缺。

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文章所用的擴增試劑:DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎型)DNA 恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

MIRA技術是一種多酶恒溫快速核酸擴增技術。其心原理是通過多種功能蛋白在常溫下協同作用,實現核酸的快速擴增,是能夠真正實現便攜式的現場快速核酸檢測的技術。

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研究方法

提取

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研究團隊從遼寧省的三個蝦養(yǎng)殖場收集了感染健康樣本,并提取了蝦的肝胰腺DNA

引物設計

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針對肝腸胞蟲的S8絲氨酸蛋白基因(基因庫登錄號:ON 182063,設計了三對MIRA引物。該基因具有獨特的活性位點,能夠保證檢測的特異性。

MIRA-AGEMIRA-LFD檢測

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(A) 優(yōu)化RPA-AGE反應溫度。M:DL 500標記物;N:陰性對照;分別為品系1-5:25°C、30°C、37°C、39°C和42°C。

(B) 優(yōu)化RPA-AGE反應時間。M:DL 500標記物;N:陰性對照;1:10 min;2:20 min;3: 30 min;4: 40 min。

(C) 優(yōu)化RPA-LFD反應溫度。N:陰性對照;1:25°C;2:30°C;3:37°C;4:39°C;5:42°C。

(D優(yōu)化RPA-LFD反應時間。N:陰性對照;1:5 min;2:10 min;3:20 min。

兩種MIRA檢測方法分別通過瓊脂糖凝膠電泳MIRA-AGE和膠體金側流免疫層析法(MIRA-LFD)實現檢測。研究團隊通過實驗優(yōu)化了反應溫度和時間。MIRA-AGE37°C下進行30分鐘擴增,而MIRA-LFD則在37°C下僅需10分鐘即可完成擴增,5分鐘內即可讀取結果。

實驗結果

特異性與靈敏度

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(A) RPA-AGE檢測的特異性。M:DL 1000標記物;P:蒿型腸孢菌;1:肝減少腸細胞;2:肝孢菌;3:微孢子蟲;4:白斑綜合征病毒;6:異常威克漢姆酵母;N:陰性對照。

(B) RPA-LFD檢測的特異性。P:蒿型腸孢菌;N:陰性對照;1:肝減少腸細胞;2:肝孢菌;3:微孢子蟲;4:白斑綜合征病毒;6:異常威克漢姆酵母。

(C) RPA-AGE對重組質粒梯度稀釋的敏感性。M: DL 500標記;N:陰性對照;1: 4.7×10^5拷貝/µL;2: 4.7×10^4拷貝/µL;3: 4.7×10^3拷貝/µL;4: 4.7×10^2拷貝/µL;5: 4.7×10拷貝/µL;6: 4.7拷貝/µL。

(D)  RPA-LFD對重組質粒梯度稀釋的敏感性。N:陰性對照;1: 4.7×10^5拷貝/µL;2: 4.7×10^4拷貝/µL;3: 4.7×10^3拷貝/µL;4: 4.7×10^2拷貝/µL;5: 4.7×10拷貝/µL;和6: 4.7拷貝/µL。

實驗顯示,MIRA技術具有高度特異性,能夠準確檢測出肝腸胞蟲,而對其他病原體無反應。靈敏度方面,兩種方法的檢測下限均為4.7copies/µL,顯著高于傳統PCR檢測的靈敏度。

臨床樣本檢測

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30個臨床樣本的檢測結果顯示,MIRA-AGEMIRA-LFD的陽性率均為70%,略低于qPCR80%的陽性率,但遠高于傳統PCR56.7%的陽性率。

應用前景

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基于MIRA的檢測方法能夠在恒溫下快速擴增目標基因,特別是MIRA-LFD方法在短短10分鐘內即可得到結果,無需復雜的實驗設備,非常適合在養(yǎng)殖場等現場環(huán)境中使用。該技術的高靈敏度和高特異性使其成為一種高效的現場檢測工具,有助于養(yǎng)殖者在早期發(fā)現和控制肝腸胞蟲的傳播,從而保護草蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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