《基于CRISPR Cas13a系統(tǒng)建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法》

張敏琳, 黃楓淇, 左小玲, 梁建韜, 梁凱珊, 單金紅, 李宗烊, 喻婕, 羅麗媛, 禤梓杰, 趙會宏, 王慶. 

基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法[J]. 水生生物學(xué)報, 2024, 48(2): 283-291. DOI: 10.7541/2023.2023.0199

大口黑鱸（Micropterus salmoides），也叫加州鱸或美國黑鱸，是一種原產(chǎn)于北美的淡水魚類，近年來在全球范圍內(nèi)成為一種重要的養(yǎng)殖魚類，因其市場需求高：大口黑鱸肉質(zhì)緊實、刺少，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，尤其富含高蛋白和低脂肪，符合消費者對健康食品的需求，因此市場售價較高，常用于高端餐飲市場。生長快：大口黑鱸生長速度較快，一般6-8個月可以達(dá)到商品規(guī)格，適合短周期養(yǎng)殖，能快速實現(xiàn)投資回報。抗病力強(qiáng)：相較于其他養(yǎng)殖魚類，大口黑鱸對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，較少爆發(fā)大規(guī)模疾病，降低了養(yǎng)殖風(fēng)險。生態(tài)養(yǎng)殖：大口黑鱸可以與其他淡水魚類如鰱魚、草魚等混養(yǎng)，有助于實現(xiàn)池塘生態(tài)平衡和資源利用最大化，進(jìn)一步提高養(yǎng)殖效益等因素，受到食客們與水產(chǎn)養(yǎng)殖戶們的歡迎，近年來其養(yǎng)殖規(guī)模快速增長。

彈狀病毒科

大口黑鱸雖然較為抗病，但在不良養(yǎng)殖環(huán)境下仍可能患上一些疾病，其中大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）危害巨大：最早于1991年在美國佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，該病毒最初是在野生大口黑鱸群體中檢測到，隨后逐漸在美國的多個淡水湖泊和水庫中傳播開來，成為大口黑鱸的主要病原之一。

透射電鏡下觀察病變細(xì)胞中的病毒粒子的形態(tài)大小

章文言，張玉軍，李陳，等.大口黑鱸彈狀病毒的分離與鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

傳播源常為受感染的魚苗或成魚、受污染的水體、以及攜帶病毒的野生魚類；這種病毒可以通過直接接觸、糞便排泄、以及水體傳播，在不良水質(zhì)或高密度養(yǎng)殖條件下更易擴(kuò)散。該病毒能引起幼魚嗜睡、漫游、腹部腫脹和體形扭曲, 以及誘導(dǎo)壞死性潰瘍和多器官出血, 一旦感染死亡率超過 90%。’

人工感染后大口黑鱸的臨床癥狀

章文言，張玉軍，李陳，等.大口黑鱸彈狀病毒的分離與鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

每年因MSRV導(dǎo)致的大口黑鱸魚苗損失超過30%, 目前關(guān)于該病毒的治療與檢測方法還不成熟, 并沒有特效藥可以醫(yī)治，故很有必要在感染之前及時發(fā)現(xiàn)病毒并做好有效的防范措施, 能夠在一定程度上減少養(yǎng)殖過程中的損失；

此外現(xiàn)有檢測技術(shù)較難做到在無復(fù)雜檢測設(shè)備的情況下開展現(xiàn)場檢測，面對這一挑戰(zhàn)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊開發(fā)出了一種MIRA結(jié)合CRISPR-系統(tǒng)的全新檢測方法，該方法特異性強(qiáng), 靈敏度高并且操作簡便, 極大提升了MSRV的檢測效率，也為盡早發(fā)現(xiàn)MSRV采取防控措施提供幫助。

安普未來生物·成品科研試劑：大口黑鱸彈狀病毒恒溫檢測試紙條型試劑盒

文章所用產(chǎn)品：RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）-II

MIRA引物對篩選

使用兩對不同MIRA引物對含有靶序列的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖位于100 bp的位置, 3個泳道均出現(xiàn)明亮的條帶, 表明有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道2和3中250 bp處為擴(kuò)增的目的條帶。用Image J軟件分別將電泳圖泳道2中長度為224 bp和泳道3中長度為255 bp的目的條帶進(jìn)行定量分析, 并用“灰度值”表示定量分析的結(jié)果。從分析結(jié)果得出, 灰度值越低表示引物利用率高, 即引物特異性結(jié)合擴(kuò)增效率高。

結(jié)果表明: 采用MIRA-F2/R2引物對時, 特異性結(jié)合擴(kuò)增效率高。

MIRA引物對篩選電泳膠圖以及灰度值分析

a. 泳道M: 2000 bp DNA marker; 泳道1. 陰性DNA樣品擴(kuò)增; 泳道2. MIRA-F1/R1引物對擴(kuò)增目的片段(方框所示224 bp);

 泳道3. MIRA-F2/R2引物對擴(kuò)增目的片段(方框所示255 bp); b. 條帶灰度值分析(方框所示)

CRISPR/Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測體系反應(yīng)結(jié)束后用紫外燈進(jìn)行照射, 觀察結(jié)果。

CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反應(yīng)體系

我們分別用RNA標(biāo)準(zhǔn)品和擴(kuò)增的樣品RNA進(jìn)行實驗,靶向目標(biāo)RNA的定位速度, crRNA2要優(yōu)于crRNA1; crRNA1比crRNA2有更強(qiáng)的最終熒光信號; crRNA1+crRNA2等比例混合使用能綜合兩者的優(yōu)點, 反應(yīng)效率更好。 

a. 用不同間隔序列的crRNA檢測標(biāo)準(zhǔn)品RNA的檢測結(jié)果比較; b. 檢測系統(tǒng)在不同溫度下檢測標(biāo)準(zhǔn)品RNA的熒光信號數(shù)據(jù)比較; 

c. 用不同濃度的RNA報告探針檢測標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號數(shù)據(jù)比較; d. 用不同濃度比率的Cas13a/crRNA探針復(fù)合物檢測標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果比較；

探究反應(yīng)溫度對檢測系統(tǒng)的影響, 設(shè)置了31℃、34℃、37℃和41℃不同反應(yīng)溫度, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測體系最佳反應(yīng)溫度是37℃。 

探究ssRNA報告探針濃度對檢測系統(tǒng)的影響, 在測試范圍內(nèi), 熒光強(qiáng)度與ssRNA報告探針濃度呈正相關(guān), ssRNA報告探針濃度在 500-700 nmol/L檢測效果差異不大, 考慮到現(xiàn)實經(jīng)濟(jì)問題, 最佳的ssRNA報告探針濃度為500 nmol/L。 

為探究不同Cas13a與crRNA的反應(yīng)濃度比對檢測系統(tǒng)的影響, 當(dāng)以每份100 nmol/L比例的基礎(chǔ)上，Cas13a﹕crRNA的比例為4﹕1和3﹕1時, Cas13a達(dá)到飽和狀態(tài); 當(dāng)Cas13a數(shù)量一定時, 熒光信號的強(qiáng)度并沒有與crRNA數(shù)量的增加呈正相關(guān)。因此, Cas13a與crRNA比例為2﹕1時, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)能夠獲得最大的檢測活性。 

靈敏度評估

為探究CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的最低檢測濃度, 故將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋, 并用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。 CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)至少能檢測到102 fM MSRV的目標(biāo)RNA。當(dāng)目標(biāo)RNA濃度低于102 fM時, 機(jī)器檢測到的熒光信號與空白對照無明顯差異。因此, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)至少能檢測到102 fM MSRV的ssRNA。 

 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的靈敏度

特異性評估

為評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)的特異性, 使用優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)檢測不同的水產(chǎn)RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV和TPNNV。只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 為陰性結(jié)果。這表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)可特異性靶向MSRV, 該檢測方法特異性很好。 

評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的特異性

樣品檢測

對從鱸魚養(yǎng)殖場采集有明顯患病跡象的病魚樣品, 驗證病魚所感染病原體是否為MSRV, 使用MSRV衣殼蛋白序列特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 電泳圖中相對應(yīng)條帶送測, 比對確認(rèn)為MSRV。 

對感染了MSRV的病魚樣品進(jìn)行預(yù)處理和預(yù)擴(kuò)增病毒RNA, 然后與陰性對照組進(jìn)行檢測。同時提取樣品的cDNA做常規(guī)檢測qPCR進(jìn)行比較。 用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)檢測出陽性樣品(3、6、7、8、9、12、13、14和15號)與常規(guī)檢測qPCR的結(jié)果一樣, 其中qPCR的CQ值處于18-25; 而陰性樣品(1、2、4、5、9、10和11號)閾值循環(huán)數(shù)則都大于38, 表明樣品無攜帶MSVR病毒。綜上所述, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)與常規(guī)檢測RT-qPCR的檢測數(shù)據(jù)相符合, 表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)的可行性且在一定程度上可以代替原先常規(guī)繁雜的檢測方法。 

a. qPCR檢測MSRV臨床樣品閾值循環(huán)數(shù)圖; 將檢測到的樣本循環(huán)數(shù)分別與陰性參照循環(huán)數(shù)用T-tests 分析(**P<0.01);

 b. Cas13a結(jié)合MIRA檢測MSRV臨床樣品熒光圖; 將檢測到的樣本熒光值分別與陰性參照熒光值用T-tests分析(**P<0.01)

綜上所述, 本研究建立的CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法不需要昂貴的實驗儀器, 可使現(xiàn)場檢測變得快速、準(zhǔn)確且方便。因此, 在實際養(yǎng)殖過程中如果采用該種檢測方法對MSRV進(jìn)行及時的發(fā)現(xiàn), 并采取針對性的有效措施, 這在很大程度上能夠減少養(yǎng)殖過程中病害帶來的損失, 并且該檢測方法快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應(yīng)用和推廣前景。

安普未來多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA技術(shù)在恒溫39°C-42°C下核酸擴(kuò)增，反應(yīng)時間僅為5-20 min。此外，不需要嚴(yán)格的實驗室條件，應(yīng)用場景多元化：綜合醫(yī)院檢驗科、基層醫(yī)療、居家檢測、田間地頭等。

試劑產(chǎn)品形態(tài)多樣化：凍干粉、凍干微球等；顯示結(jié)果的多樣性：凝膠電泳、熒光曲線、膠體金試紙條等。試劑性能穩(wěn)定、便于操作、方便存儲運輸。

并以MIRA為核心平臺技術(shù)研發(fā)出“超快速核酸釋放技術(shù)”、“雙通道恒溫?zé)晒鈾z測儀”、“一體化全自動封閉檢測系統(tǒng)”、“自測型核酸檢測裝置”等一系列配套產(chǎn)品，打造快速分子檢測整體解決方案。