《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》

轉(zhuǎn)基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國家逐步完善轉(zhuǎn)基因監(jiān)管措施以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全。開發(fā)快速和準確的基因現(xiàn)場檢測方法對農(nóng)業(yè)和生物安全非常重要，可以減輕公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的擔心。

在本研究中，課題組開發(fā)了一種新的一鍋法反應——雙重MIRA檢測結(jié)合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用于同時檢測轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點，為轉(zhuǎn)基因作物的檢測提供了一種簡單高效的檢測方法。

實驗方法

將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統(tǒng)進行分析，產(chǎn)生兩個互不干擾的獨立信號，再通過照明儀器讀取熒光顏色，或通過帶有兩條T線的試紙條，以實現(xiàn)雙通道讀出。整個過程在不到35 min的時間內(nèi)完成，檢測限低至20個拷貝。

（MR-DCA檢測CaMV35S和NOS的原理）

整個實驗分為3個步驟：MIRA擴增、CRISPR反應、2種方式的結(jié)果判讀。

CaMV35S基因作為Cas13a的靶標，NOS基因作為Cas12a的靶標，分別設計了兩對MIRA引物。Cas13a系統(tǒng)只識別RNA，因此設計了正向引物區(qū)域，包含一個T7啟動子，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結(jié)合，且兩個系統(tǒng)之間不存在干擾或交叉反應。

實驗情況

l 靈敏度和特異性

將樣本梯度稀釋來測試MIRA反應的熒光強度，發(fā)現(xiàn)樣本濃度在20μL時仍能檢測到熒光強度，最終實驗選定20μL的濃度。

（不同樣本濃度和試紙條顯色測試并用強度量化計算）

為了進一步評價MR-DCA的特異性，課題組對非轉(zhuǎn)基因動物混合樣品和非轉(zhuǎn)基因植物混合樣品進行了檢測。結(jié)果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉(zhuǎn)基因樣品具有較高的熒光信號，而其他樣品的熒光強度與陰性對照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點核酸檢測平臺。

用MR-DCA對24個作物樣品進行了測試。 其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉(zhuǎn)基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因大豆。

（24個樣本的檢測結(jié)果）

l反應快速

反應時間是現(xiàn)場檢測的一個重要因素，課題組觀察到在反應時間為10 min時，就已經(jīng)能用熒光儀檢測到FAM和HEX的熒光信號。MIRA結(jié)合CRISPR反應，也在15min后觀察到黃色熒光。

（不同MIRA反應時間下的熒光信號）

（MIRA反應不同時間下的試紙條顯色并用強度量化計算）

l 實驗結(jié)論

實驗結(jié)果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，并能準確地獲得CaMV35S和NOS的擴增產(chǎn)物，Cas13a和Cas12a系統(tǒng)獨立反應，互不干擾。MR-DCA檢測能在35min的低溫下準確檢測到20個拷貝，具有在田間檢測轉(zhuǎn)基因作物的巨大價值。

文章信息

期刊名稱：《Journal of Advanced Research》

文章標題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》

影響因子：11.4

研究團隊：浙江省農(nóng)業(yè)科學院汪小福

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