溶血葡萄球菌是一種革蘭氏陽性凝固酶陰性細菌，在醫(yī)院中非常常見。近年來由于醫(yī)院獲得性感染的風險較高，受到越來越多的關注。溶血葡萄球菌可進一步導致皮膚感染、腦膜炎、腹膜炎，甚至敗血癥。臨床診斷的延遲會導致健康狀況的惡化，因此快速診斷溶血葡萄球菌是精確治療的關鍵。

中國連云港市第二人民醫(yī)院中央實驗室科的季拓老師課題組，在《Analytica Chimica Acta》期刊上發(fā)表文章《A rapid and visual detection of Staphylococcus haemolyticus in clinical specimens with MIRA-LFS》，影響因子6.2。

1.研究概述

在該研究中，建立了一種基于mvaA基因的MIRA-LFS檢測溶血葡萄球菌的方法，使用多酶恒溫快速核酸擴增技術MIRA與側流試紙條LFS結合，實現(xiàn)快速病原體檢測。

實驗在37℃下進行，可在9min內(nèi)檢測到結果，檢測靈敏度為0.147CFU/反應。

MIRA-LFS檢測方法適用于臨床樣本中溶血葡萄球菌的定點檢測，實現(xiàn)了POCT鑒別溶血葡萄球菌的方法，對醫(yī)療服務不足地區(qū)的快速疾病診斷和治療具有重要價值。

課題組用MIRA-LFS、qPCR和傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法對95個隨機臨床樣本進行分析，證實了臨床適用性。

2.研究方法

MIRA-LFS檢測示意圖如上所示。

研究使用了安普未來生物的DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）、核酸檢測試紙條。

mvaA基因引物長度為30-35個核苷酸，擴增產(chǎn)物長度為100-350bp，共設計6對候選引物。利用標準溶血葡萄球菌菌株的gDNA進行MIRA分析，篩選候選引物，用2%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物。

（使用瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物）

再根據(jù)正向引物序列（向后延伸16bp）設計探針。探針的5’端用FITC標記，3’端標記C3阻斷。利用THF替換探針中31位的核苷酸，THF距離5’端30bp，距離3’端15bp。所選的反向引物的5’端用生物素進行標記。

（引物探針組合的交叉二聚體和序列修飾示意圖）

并且，課題組優(yōu)化了溶血葡萄球菌MIRA-LFS檢測的反應條件。在37℃下，從4-12min每間隔2min進行測試。結果顯示在8min反應時間，試驗線清晰可見。另外，從22-52℃，每間隔5℃進行測試。37-42℃是最適合MIRA-LFS檢測的溫度。因此，溶血葡萄球菌MIRA-LFS法的最佳反應時間和溫度，分別為8min和37℃。加上最終結果在1min內(nèi)通過LFS可視化，總檢測時間為9min。

（反應時間、溫度的優(yōu)化）

3.實驗結果

1. 靈敏度驗證

從連續(xù)稀釋的溶血葡萄球菌培養(yǎng)物（10^6-10^0CFU/mL）中獲得的不同濃度的基因組DNA（gDNA）進行MIRA-LFS檢測。

（不同濃度下的陽性信號）

通過概率單位回歸分析顯示，MIRA-LFS檢測法測定的95% LOD為0.147CFU/反應。

（檢測限計算）

2. 特異性驗證

通過分析18株常見的致病微生物菌株和15株臨床溶血葡萄球菌菌株，測定了溶血葡萄球菌MIRA-LFS檢測的選擇性。結果顯示，MIRA-LFS檢測對其他18種致病菌均為陰性，對15個已驗證的溶血葡萄球菌臨床樣本均呈陽性。

（分別檢測8株標準致病菌菌株、15株臨床溶血性鏈球菌菌株）

MIRA-LFS檢測具有高選擇性，適合溶血葡萄球菌的篩選。

3.實際樣本檢測

連云港第二人民醫(yī)院隨機采集的95份標本，包含皮膚軟組織35份、尿液16份、痰14份和血液30份樣本。

（不同方法檢測95例臨床標本）

結果表明，該檢測方法與qPCR法符合度達100%。此外，與金標準（GB/T4789.11-2003）相比，MIRA-LFS檢測方法鑒定溶血葡萄球菌感染的靈敏度和特異性分別為100%和98.73%。這些結果進一步驗證了該方法在檢測臨床樣本中溶血葡萄球菌的技術可行性。

MIRA-LFS方法用于快速POCT檢測溶血葡萄球菌，具備高效、準確、簡單、經(jīng)濟成本低的特性，有助于快速做出診斷和治療決策。

了解MIRA技術

安普未來多酶恒溫快速核酸擴增技術MIRA技術在恒溫39°C-42°C下核酸擴增，反應時間僅為5-20 min。此外，不需要嚴格的實驗室條件，應用場景多元化：綜合醫(yī)院檢驗科、基層醫(yī)療、居家檢測、田間地頭等。

試劑產(chǎn)品形態(tài)多樣化：凍干粉、凍干微球等；顯示結果的多樣性：凝膠電泳、熒光曲線、膠體金試紙條等。試劑性能穩(wěn)定、便于操作、方便存儲運輸。

并以MIRA為核心平臺技術研發(fā)出“超快速核酸釋放技術”、“雙通道恒溫熒光檢測儀”、“一體化全自動封閉檢測系統(tǒng)”、“自測型核酸檢測裝置”等一系列配套產(chǎn)品，打造快速分子檢測整體解決方案。